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Title: Validation of a methodology for determination of polyamines in urine by High Performance Liquid Chromatography (HPLC): Validation of a methodology for determination of polyamines in urine by High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Validación de una metodología para la determinación de poliaminas en orina por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC): Validation of a methodology for determination of polyamines in urine by High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Keywords: Poliaminas;orina;HPLC;validación
Description: The levels of polyamines (PAs) in urine are an important biomarker of physiological and pathological phenomena for humans. Due to its importance, the validation of a PAs determination methodology was validated for (Putrescine (Pu), Cadaverine (Cdv), Spermidine (Spd), Spermine (Spm), Epinephrine (Epf) and Histamine (Hst) in urine by Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) with pre- column derivatization using dansyl chloride and UV detection at 254 nm. To this aim, selectivity, working range and linearity, detection /quantification limit were determined. The precision (as repeatability and precision under intermediate conditions), accuracy (measured as recovery) and robustness were established. The methodology was adapted from the Chilean Standard for the detection of histamine and other biogenic amines in fish and shellfish ME-711.O4-070, 2014, so it was necessary to implement adjustments for its application in urine. The results showed that amino acids (AAs) did not cause interference in the analysis of PAs, and allow determination of concentrations in the linear range between 4 and 28 µg/mL. However, good recovery (accuracy) was not obtained in the experiment, possibly because the standards used were not acetylated (42.6% Pu and 69% Cdv). The present methodology allows determining the levels of Pu, Cdv, Spd, Spm Hst and Efd in urine samples from humans and other mammalian species.
Los niveles de poliaminas (PAs) en orina constituyen un importante biomarcador de fenómenos fisiológicos, y patológicos para el ser humano. Dada su importancia, se eligió como objetivo del presente trabajo la validación del método de PAs (Putrescina (Pu), Cadaverina (Cdv), Espermidina (Spd), Espermina (Spm), Epinefrina (Epf) e Histamina (Hst) en orina por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución en fase reversa (RP- HPLC) con derivatización pre- columna con cloruro de dansilo y detección UV a 254 nm. Para ello se determinaron la selectividad; rango de trabajo y linealidad; límite de detección/límite de cuantificación; precisión (repetibilidad y precisión en condiciones intermedias); exactitud (medida como recuperación) y robustez. Se partió del método reportado en la Norma chilena para la detección de histamina y otras aminas biógenas en pescado y mariscos ME-711.O4-070, 2014, por lo que fue necesario implementar ajustes para su aplicación en orina. Los resultados demostraron que los aminoácidos (AAs) no causaban interferencias en el análisis de PAs, y permiten determinar concentraciones en el rango lineal entre 4 y 28 μg/mL. No obstante, no se obtuvo buena recuperación (exactitud) en el experimento, posiblemente debido a que los estándares utilizados no eran acetilados (42.6143% de Pu y 69% de Cdv). La metodología permite determinar los niveles de Pu, Cdv, Spd, Spm Hst y Efd en muestras de orina de humanos y otras especies de mamíferos.
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