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https://hdl.handle.net/20.500.12104/112612Registro completo de metadatos
| Campo DC | Valor | Lengua/Idioma |
|---|---|---|
| dc.contributor.advisor | Gutiérrez Becerra, Alberto | |
| dc.contributor.author | Bravo Lozano, Lizeth Montserrat | |
| dc.date.accessioned | 2026-04-13T19:55:08Z | - |
| dc.date.available | 2026-04-13T19:55:08Z | - |
| dc.date.issued | 2025-10-31 | |
| dc.identifier.uri | https://wdg.biblio.udg.mx | |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/20.500.12104/112612 | - |
| dc.description.abstract | Las terapias basadas en ácidos nucleicos han emergido como herramientas prometedoras para tratar enfermedades genéticas, neurodegenerativas y hasta ciertos tipos de cáncer mediante la inserción controlada de material genético dentro de las células. Sin embargo, su avance depende de la disponibilidad de vectores capaces de proteger, transportar y liberar los genes con alta eficiencia y mínima citotoxicidad. Entre los candidatos más prometedores se encuentra la poli-L-lisina (PLL), un polipéptido catiónico biocompatible y biodegradable, capaz de condensar ADN por interacciones electrostáticas en los llamados complejos polielectrolíticos. Sin embargo, su uso ha sido limitado debido a la falta de estudios que analicen su capacidad para formar complejos con ácidos nucleicos, describan en detalle sus propiedades fisicoquímicas y establezcan la relación entre estas características y su eficiencia biológica, así como su estabilidad y eficacia terapéutica. El presente trabajo aborda esta problemática desde una perspectiva integral y multidisciplinaria, mediante el estudio de los mecanismos y la cinética de formación, la estructura, la estabilidad coloidal y la disociación de complejos formados por poli-L-lisina (PLL) y su análogo, propargil-Poli(N-lisina) (PNL), con el plásmido peGFP-C3. Estos estudios se complementan con ensayos biológicos de transfección y viabilidad celular, con el objetivo de profundizar en la comprensión de los complejos a base de polipéptidos y ácidos nucleicos y sus aplicaciones terapéuticas. | |
| dc.description.tableofcontents | RESUMEN ............................................................................................................ 19 INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 21 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 23 HIPÓTESIS ........................................................................................................... 23 OBJETIVOS .......................................................................................................... 24 I. Objetivo general .............................................................................................. 24 II. Objetivos específicos ...................................................................................... 24 MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 26 1.1 Terapia génica ............................................................................................ 26 1.1.1 Enfermedades monogénicas ...................................................................... 26 1.1.2 Enfermedades neurodegenerativas ............................................................ 26 1.1.3 Enfermedades carentes de tratamiento ...................................................... 27 1.2 Métodos para el transporte de genes. ........................................................ 28 1.2.1 Vectores virales .......................................................................................... 28 1.2.2 Vectores no virales. .................................................................................... 28 1.3 Complejos polielectrolíticos (CPEs) ............................................................ 31 1.4 Disociación de los CPEs. ............................................................................ 36 1.5 Polilisina (PLL) ............................................................................................ 40 1.5.1 Síntesis ....................................................................................................... 40 1.6 Aplicaciones de la (PLL) ............................................................................. 41 1.6.1 Complejos PLL/ADN ................................................................................... 42 TÉCNICAS EXPERIMENTALES ........................................................................... 46 2.1 Espectroscopía por Resonancia Magnética Nuclear de Protón (1H RMN) . 46 2.2 Potencial- .................................................................................................. 47 2.3 Dispersión dinámica de luz (DLS) .............................................................. 48 2.4 Electroforesis en gel ................................................................................... 50 2.5 Titulaciones conductimétricas ..................................................................... 52 2.6 Microscopía de fuerza atómica (AFM) ........................................................ 54 2.7 Microscopía de fluorescencia ..................................................................... 55 2.8 Espectroscopía en flujo detenido (Stopped Flow) ...................................... 56 2.9 Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) .................................... 57 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 62 3.1 Materiales ................................................................................................... 62 3.2 Métodos ...................................................................................................... 64 3.2.1 Preparación de soluciones ........................................................................... 64 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 76 4. Estequiometría y cinética de formación de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 ..................................................................................................... 77 4.1 Caracterización de las muestras de poli-L-lisinas ........................................... 77 4.1.1 Determinación de la estructura de las poli-L-lisinas mediante 1H RMN ...... 78 4.1.2 Determinación del peso molecular y del índice de polidispersidad mediante SEC . 81 4.1.3 Titulaciones potenciométricas y mediciones de potencial- ...................... 82 4.2 Estequiometría de formación de complejos polipéptido/peGFP-C3 ................ 84 4.2.1 Titulaciones de potencial- ........................................................................... 84 4.2.2 Titulaciones conductimétricas ...................................................................... 89 4.2.3 Ensayos de electroforesis en gel .................................................................. 91 4.2.4 Tabla de formulaciones ................................................................................ 93 4.3 Cinética de formación de complejos polipéptido/peGFP-C3 ........................... 95 4.3.1 Ajuste cinético mediante modelos exponenciales ........................................ 97 4.4 Conclusiones de este capítulo ....................................................................... 102 5. Formulación y caracterización de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3.105 5.1 Formulación de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 ................. 105 -C3 5.2 Formulación de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 .......... 106 5.2.1 Determinación del tamaño de partícula mediante DLS .............................. 106 5.2.2 Determinación del potencial- de los complejos ......................................... 109 5.2.3 Estudio de la morfología de los complejos mediante AFM ......................... 112 5.2.4 Análisis estructural de los complejos mediante SAXS ............................... 115 5.3 Conclusiones de este capítulo ....................................................................... 121 6. Evaluación de la estabilidad coloidal y eficiencia de transfección de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 ...................................................... 123 6.1 Estabilidad en medios biológicos .................................................................. 124 6.2 Estabilidad en temperatura ............................................................................ 126 6.3 Estabilidad en el tiempo ................................................................................ 129 6.4 Influencia de la presencia de polianiones biológicos ..................................... 130 6.5 Evaluación de la eficiencia de transfección y viabilidad celular ..................... 135 6.5.1 Expresión de la GFP en células HEK293 ................................................... 135 6.5.2 Evaluación de la viabilidad celular mediante la cuantificación de ATP ....... 137 6.6 Conclusiones de este capítulo ....................................................................... 139 CONCLUSIONES ................................................................................................ 141 PERSPECTIVAS ................................................................................................. 145 ANEXOS ............................................................................................................. 148 Figura 1.1. Estructura química de la Polietilenimina (PEI) a) lineal y b) ramificada. .............................................................................................................................. 28 Figura 1.2. Estructura química del quitosano. ...................................................... 29 Figura 1.3. Estructura química clásica de la Polilisina. ......................................... 30 Figura 1.4. Esquema simplificado sobre la formación de complejos polielectrolíticos (CPEs) mediante interacciones electrostáticas. .................................................... 31 Figura 1.5. Esquema de la formación e internalización de los CPEs mediante el mecanismo de endocitosis. Tras la internalización, los complejos son dirigidos a endosomas tempranos (pH 6.0–6.5) y posteriormente a endosomas tardíos (pH 5.05.5) o lisosomas (pH 4.5–5.0), donde pueden sufrir degradación. Alternativamente, los CPEs pueden escapar del endosoma y liberar el material genético en el citoplasma, donde interactúan con rutas específicas, como la formación de complejos con GAGs y la expresión génica nuclear . ........................................... 34 Figura 1.6. a) Representación del complejo PLL/ADN y b) su disociación en presencia de CaCl2 0.52 M. Los iones Ca2+ se muestran como esferas color verde, que se unen progresivamente a los grupos fosfatos del ADN. La molécula de ADN utilizada en las simulaciones es el d(CGCGAATTCGCG), con una carga neta de −22e. El PLL de las simulaciones es un polipéptido lineal de 20 lisinas totalmente protonadas, con una carga neta total de la PLL de +20e. ..................................... 36 Figura 1.7. Estructura química del sulfato de condroitina. .................................... 37 Figura 1.8. Estructura química de ácido hialurónico. ............................................ 37 Figura 1.9. Estructura química de la heparina. ..................................................... 38 Figura 1.10. Síntesis ROP de la a) propargil-Poli(L-lisina) y b) propargil-Poli(Nlisina). .................................................................................................................... 40 Figura 2.1. Representación gráfica de la espectroscopía RMN. ........................... 45 Figura 2.2. Representación esquemática del potencial-, la carga superficial de una partícula cargada negativamente, la capa de Stern y la doble capa eléctrica. ...... 46 Figura 2.3. Representación esquemática de la dispersión dinámica de luz (DLS) para una detección a un ángulo de dispersión θ. .................................................. 48 Figura 2.4. Representación esquemática de las fluctuaciones en la intensidad de la luz dispersada y sus funciones de correlación correspondientes de suspensiones con diferentes tamaños de partículas. ................................................................... 49 Figura 2.5. Representación esquemática de la electroforesis en gel horizontal. .. 50 Figura 2.6. Escalera de referencia para el peso molecular, en términos de los pares de base (bp) y la conformación del ADN plasmídico en un gel de 1% en peso de agarosa en TAE. ................................................................................................... 51 Figura 2.7. Titulación conductimétrica de HCl 0.1 M con NaOH a la misma concentración, en agua. ........................................................................................ 52 Figura 2.8. Representación esquemática de la microscopía de fuerza atómica (AFM). ................................................................................................................... 53 Figura 2.9. Esquema representativo de la técnica de stopped-flow empleada para el estudio de la cinética de reacción. Dos soluciones de reactivos son impulsadas a alta velocidad mediante jeringas independientes y se mezclan de manera eficiente en una microcámara de reacción. El flujo es detenido bruscamente por un pistón de parada (stop syringe), lo que permite iniciar la adquisición de datos desde tiempos del orden de milisegundos. La evolución de la reacción es monitoreada mediante un sistema óptico de detección. ................................................................................. 55 Figura 2.10. Representación esquemática del principio de la técnica de Dispersión de Rayos X de ángulo pequeño (SAXS) mediante la incidencia de un haz de rayos X sobre una muestra y la detección de la intensidad dispersada en función del vector q.. .......................................................................................................................... 56 Figura 2.11. Esquema representativo del modelo de frambuesa: Núcleo de radio RO con pequeños agregados de radio Rp, al factor de penetración radial δ (modificado) .............................................................................................................................. 59 Figura 4.1. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli-L-lisina comercial PLLcom860 (Mw=70 -150 kDa). ................................................................................................ 77 Figura 4.2. Evolución del potencial-ζ y del pH en función de la cantidad agregada de NaOH 0.1 M para: a) PLLcom400, b) PLLcom860, c) PLLcom1800 y d) PLLcom2400. CPLL=0.2 mg/mL, VPLL=4 mL……. .......................................................................... 81 Figura 4.3. Evolución del potencial-ζ y del pH en función de la cantidad agregada de NaOH 0.1 M para: a) la PLL100, y b) la PNL100. CPolicatión=0.2 mg/mL, VPolicatión=4 mL……. ................................................................................................................. 82 Figura 4.4. Potencial- en función de la relación de cargas R=[N+]/[P-] durante la formación de complejos: (a) PLL20/peGFP-C3 y (b) PNL20/peGFP-C3. La titulación se realizó con una solución inicial de plásmido en un V de 5 mL, con C=0.005 mg/mL, y soluciones de policatión (PLL20 o PNL20, C=0.5 mg/mL), preparadas a un pH de 7.4. ……. ..................................................................................................... 84 Figura 4.5. Potencial- en función del volumen de polipéptido durante la formación de complejos: (a) PLL/peGFP-C3 y (b) PNL/peGFP-C3, utilizando una solución inicial de plásmido de 5 mL a 0.005 mg/mL, y soluciones de polipéptido DP=20, 50 y 100, preparadas a 0.5 mg/mL a un pH de 7.4 ……............................................. 85 Figura 4.6. Potencial- en función del volumen de PLL durante la formación de complejos PLL/peGFP-C3 utilizando 4 muestras PLLcom400, PLLcom860, PLLcom1800 y PLLcom2400. La solución inicial de polianión fue de 5 mL a 0.005 mg/mL, y las soluciones de policatión se prepararon a 0.5 mg/mL y protonadas a pH 7.4.……. ........................................................................................................ 86 Figura 4.7. Evolución de la conductividad en función de la relación de cargas R=[N+]/[P-] durante la formación de complejos (a) PLL20/peGFP-C3 y (b) PNL20/peGFP-C3. La titulación se realizó con una solución inicial de plásmido (5 mL, C=0.005 mg/mL) y soluciones de policatión (PLL100 o PNL100, C=0.5 mg/mL), preparadas a un pH de 7.4. .……. ......................................................................... 88 Figura 4.8. Ensayos de electroforesis en gel en función de la relación de carga, [N+]/[P-], que evalúan la movilidad electroforética del plásmido peGFP-C3 en presencia de PLL20 y PNL20. El marcador contiene muestras de plásmidos de ADN (pDNA) con diferentes pesos moleculares (SmartLadder Mw-1700-10 Eurogentec). CpeGFP-C3 = 0.05 mg/mL preparado en agua, compactado mediante la adición de las soluciones de PLL a una concentración de 0.06 mg/mL y PNL a 0.1618 mg/mL, ambas a pH de 7.4. El volumen total de solución de complejos es de 20 L ........ 91 Figura 4.9. Ensayos de electroforesis en gel en función de la relación de carga, [N+]/[P-], evaluando la movilidad electroforética del plásmido peGFP-C3 en presencia de PLLcom400 y PLLcom2400. El marcador contiene muestras de plásmidos de ADN (pDNA) con diferentes pesos moleculares (SmartLadder Mw-1700-10 Eurogentec). CpeGFP-C3 = 0.05 mg/mL, compactado mediante la adición de las soluciones de PLL a una concentración de 0.07 mg/mL y pH=7.4. El volumen total de solución de complejos es de 20 L. ................................................................. 92 Figura 4.10. Intensidad de luz dispersada en función del tiempo, medida por flujo detenido, para evaluar la cinética de formación de complejos: a) PLL20/peGFP-C3. B) PNL20/peGFP-C3, c) PLLcom860/peGFP-C3 y d) PLLcom2400/peGFP-C3, preparados a diferentes relaciones de carga (R = [N+]/[P-]= 0.5, 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2 y 3). La CpeGFP-C3= 0.034 mg/mL se mantuvo constante. ............................................... 95 Figura 4.11. Ajustes cinéticos de la formación de complejos a) PLL20/ peGFP-C3, b) PNL20/ peGFP-C3, c) PLLcom860/peGFP-C3 y d) PLLcom2400/peGFP-C3, mediante el ajuste i. doble y ii. triple exponencial, realizado en el programa Origin. .............................................................................................................................. 98 Figura 5.1. Distribuciones de tamaño obtenidas para intensidad, diámetro hidrodinámico (DH) y polidispersidad (PDI) para los complejos formados con peGFP-C3 0.034 mg/mL y soluciones de a) PLL20, b) PLL50, c) PLL100, d) PNL20, e) PNL50, f) PNL100, g) PLLcom400, h) PLLcom860, i) PLLcom1800 y j) PLLcom2400 a 5 mg/mL y pH=7.4, preparados a R=[N+]/[P-] = 5, 10 y 15. ................................................... 106 Figura 5.2. Diámetro hidrodinámico (DH) promedio de los complejos formados con peGFP-C3 0.034 mg/mL y soluciones de PLL20, PLL50, PLL100, PNL20, PNL50, PNL100, PLLcom400, PLLcom860, PLLcom1800 y PLLcom2400 a 5 mg/mL y pH=7.4. Los complejos se prepararon a R = 5, 10 y 15. .......................................................... 107 Figura 5.3. Potencial- promedio de los complejos formados con peGFP-C3 0.034 mg/mL y soluciones de PLL20, PLL50, PLL100, PNL20, PNL50, PNL100, PLLcom400, PLLcom860, PLLcom1800 y PLLcom2400 a 5 mg/mL y pH=7.4. Los complejos se prepararon a R = 5, 10 y 15. .................................................................................................. 107 Figura 5.4 Imágenes AFM (i) y distribuciones de tamaños en función del % de partículas (ii) para los complejos formados con peGFP-C3 0.034 mg/mL y soluciones de a) PLL20, b) PNL20, c) PLLcom400, d) PLLcom860, e) PLLcom1800 y f) PLLcom2400, a 5 mg/mL y pH=7.4, preparados a R=[N+]/[P-] = 5, con una dilución 1/10. ............................................................................................................................ 113 Figura 5.5 Intensidad dispersión I(q) en función del vector de onda q para complejos PLL/peGFP-C3 y PLL/peGFP-C3 preparados con PLL100, PNL100, PLLcom400, PLLcom860, PLLcom1800, y PLLcom2400, a R=10. ........................................................ 115 Figura 5.6 Determinación de pendientes características para la curva SAXS de complejos PNL100/peGFP-C3, R = 10, en las regiones de (a) bajo, (b) intermedio y (c) alto q. ............................................................................................................. 116 Figura 5.7 Ajuste matemático de los perfiles dispersión SAXS con el modelo de frambuesa esférica para los complejos (a)PNL20/peGFP-C3 y (b) PLL20/peGFP-C3 a R=10, realizado con el programa SasView. CpeGFP-C3=0.034 mg/mL. ............... 118 Figura 6.1. Estudio de la estabilidad en presencia de PBS y medio de cultivo DMEM en las distribuciones de tamaño promedio (diámetro hidrodinámico) por intensidad obtenidas para los complejos (a) PLL100/ADN, (b) PNL100/ADN y (c) PLLcom2400/ADN preparados a R=[N+]/[P-] = 15, utilizando ADN plasmídico eGFP-C3 a una concentración de 0.034 mg/mL. .......................................................................... 123 Figura 6.2. Distribución de tamaños para una muestra de medio de cultivo DMEM + 10% FBS (suero) obtenida mediante DLS. ...................................................... 124 Figura 6.3. Evaluación del diámetro hidrodinámico en función de la temperatura obtenido mediante DLS para los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 preparados a (a) R=5 y (b) R=15, utilizando ADN plasmídico eGFP-C3 a una concentración de 0.034 mg/mL. .......................................................................... 126 Figura 6.4. Evaluación del diámetro hidrodinámico en función de la temperatura obtenido mediante DLS para los complejos PNL100/peGFP-C3, Quitosano MMW/peGFP-C3 y PEI25 kDa/peGFP-C3 preparados a (a) R=5 y (b) R=15, utilizando ADN plasmídico eGFP-C3 a una concentración de 0.034 mg/mL. ...................... 127 Figura 6.5. Evaluación del diámetro hidrodinámico en función del tiempo obtenido mediante DLS para los complejos PLL /peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3, preparados a (a) R=5 y (b) R=15, utilizando ADN plasmídico eGFP-C3 a una concentración de 0.034 mg/mL. ...................................................................................................... 128 Figura 6.6. Potencial- en función del volumen de PLL100 durante la formación de complejos con (a) ácido hialurónico, (b) sulfato de condroitina de tiburón y (c) de bovino, utilizando una solución inicial de polianión de 5 mL a una C=0.034 mg/mL, y de policatión a C=1 mg/mL, protonado a pH=7.4. ............................................ 129 Figura 6.7. Estudio de estabilidad, mediante electroforesis en gel, de complejos (a) PNL20/peGFP-C3 y (b) PLL20/peGFP-C3. CpeGFP-C3 = 0.005 mg/mL; CPNL20 = 0.1618 mg/mL y CPLL20=0.06 mg/mL, a un pH de 7.4, R = 3. .......................................... 131 Figura 6.8. Estudio de estabilidad mediante electroforesis en gel, de los complejos PLL100/peGFP-C3 preparados a (a) R = 3, (b) 5, (c) 10 y (d) 15, con C. CpeGFP-C3 = 0.005 mg/mL, CPLL100=0.06 mg/mL, a un pH de 7.4. ........................................... 132 Figura 6.9. Evolución de la estabilidad en presencia de heparina, mediante electroforesis en gel, de los complejos PLLcom/peGFP-C3 preparados a R = 5, utilizando las muestras (a) PLLcom400, (b) PLLcom860, (c) PLLcom1800 y (d) PLLcom2400, con CpeGFP-C3 = 0.005 mg/mL, CPLLcom=0.07 mg/mL, a un pH de 7.4. .................. 132 Figura 6.10. Estudio de estabilidad, mediante electroforesis en gel, de complejos PLLcom860, en presencia de (a) sulfato de condroitina y (b) ácido hialurónico, a concentraciones de 0.1 mg/mL. CpeGFP-C3 = 0.005 mg/mL; CPLLcom860 = 0.07 mg/mL, a un pH de 7.4, R = 3. ......................................................................................... 134 Figura 6.11. Observaciones in situ mediante microscopía de fluorescencia para la transfección de complejos PNL20/peGFP-C3, PLL20/peGFP-C3 y PLLcom860/peGFPC3 durante (a) 24 y (b) 40 horas. La línea celular HEK293 se cultivó en medio DMEM con 10 % de FBS, L-glutamina y antibióticos, a 37°C. ........................................ 135 Figura 6.12. Eficiencia de transfección celular en términos del porcentaje (%) de células positivas HEK293T a la GFP, para las diferentes muestras de polilisinas, utilizando lipofectamina como control positivo..................................................... 136 Figura 6.13. Cantidad de ATP producida por las células HEK293T después de la transfección de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 con (a) 48 y (b) 72 horas de incubación. Los resultados se presentan para la transfección de los complejos preparados a R = 5, 10 y 15. .............................................................. 137 Figura 8.1. Esquema representativo de la metodología para los experimentos de electroforesis en gel. ........................................................................................... 150 Figura 8.2. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(L-lisina) PLL20 ...................... 159 Figura 8.3. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(L-lisina) PLL50 ...................... 159 Figura 8.4. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(L-lisina) PLL100 ..................... 160 Figura 8.5. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(N-lisina) PNL20 ..................... 160 Figura 8.6. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(N-lisina) PNL50 ..................... 161 Figura 8.7. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(N-lisina) PNL100 .................... 161 Figura 8.8. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(L-lisina) PLLcom400 .............. 162 Figura 8.9. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(L-lisina) PLLcom860 .............. 162 Figura 8.10. Espectro 1H-RMN en D₂O para la poli(L-lisina) PLLcom2400 ........... 163 Figura 8.11. Perfiles de SEC para las muestras de poli(N-lisina): (a)PNL20, (b)PNL50 y (c)PNL100 obtenidas a partir de un detector de índice de refracción. ................ 164 Figura 8.12. Perfiles de SEC para las muestras de poli(L-lisina): (a)PLL20, (b)PLL50 y (c)PLL100 obtenidas a partir de un detector de índice de refracción. ................ 164 Figura 8.13. Evolución del potencial-ζ y del pH en función de la cantidad agregada de NaOH 0.1 M para: a) PLL20, b) PLL50, c) PNL20, d) PNL50, e) PLLcom400, f) PLLcom860, g) PLLcom1800 y h) PLLcom2400. ....................................................... 166 Figura 8.14. Evolución de la conductividad en función de la relación de cargas R=[N+]/[P-] durante la formación de complejos a) PLL50, b) PLL100, c) PNL50, d) PNL100, e) PLLcom400, f) PLLcom860, g) PLLcom1800 y h) PLLcom2400. La titulación se realizó con una solución inicial de plásmido (5 mL, C=0.005 mg/mL) y soluciones de policatión C=0.5 mg/mL), preparadas a un pH de 7.4. ....................................... 168 Figura 8.15. Ensayos de electroforesis en gel en función de la relación de carga, [N+]/[P-], evaluando la movilidad electroforética del plásmido peGFP-C3 en presencia de a) PLL50, b) PLL100, c) PNL50, d) PNL100, e) PLLcom400, f) PLLcom860, g) PLLcom1800 y h) PLLcom2400. El marcador contiene muestras de plásmidos de ADN (pDNA) con diferentes pesos moleculares (SmartLadder Mw-1700-10 Eurogentec). CpeGFP-C3 = 0.05 mg/mL, compactado mediante la adición de las soluciones de PLL y PNL a concentraciones según la Tabla 7.1 y pH=7.4. El volumen total de solución de complejos es de 20 L. ......................................... 170 Figura 8.16. Determinación de pendientes características para la curva SAXS de complejos: a) PLL100/peGFP-C3, b) PLLcom400, c) PLLcom860, d) PLLcom1800 y d) PLLcom2400, preparados a R = 10 con base en los cálculos de la Tabla 8.6, en las regiones de (a) bajo, (b) intermedio y (c) alto q. .................................................. 171 Figura 8.17. Ajuste matemático de los perfiles SAXS de complejos: a) PLL100/peGFP-C3, b) PLLcom400, c) PLLcom860, d) PLLcom1800 y d) PLLcom2400 mediante el modelo núcleo-coraza, utilizando el programa SasView. ................. 173 Figura 8.18. Estudio de la estabilidad en presencia de PBS y medio de cultivo DMEM en las distribuciones de tamaño promedio (diámetro hidrodinámico) por intensidad obtenidas para los complejos a) PLL20/ADN, b) PLL50/ADN, c) PLL100/ADN, d) PNL20/ADN, e) PNL50/ADN, f) PNL100/ADN, g) PLLcom400/ADN, h) PLLcom860/ADN, i) PLLcom1800/ADN y j) PLLcom2400/ADN, preparados a R=[N+]/[P] = i.5 y ii.15, utilizando ADN plasmídico eGFP-C3 a una concentración de 0.034 mg/mL. ................................................................................................................ 175 Tabla 1.1. Tabla comparativa para complejos PLL/ADN a diferentes condiciones de preparación y frente a otros sistemas de complejos para la terapia génica. A pesos moleculares y relaciones de carga elevadas, la eficiencia de transfección de los complejos a base de polilisinas se incrementa. También se destaca su biocompatibilidad. .................................................................................................. 43 Tabla 2.1. Fluoróforos más comunes y sus longitudes de onda de emisión y de excitación características. ..................................................................................... 55 Tabla 3.1. Muestras de polilisinas y su nomenclatura, para la formación de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3. ....................................................... 63 Tabla 3.2. Tabla de formulaciones para la transfección de complejos PLL/peGFPC3 y PNL/peGFP-C3, preparados con soluciones de policatión a 5 mg/mL y pH=7.4, y una concentración de plásmido de 0.034 mgmL en un volumen total de 800 L. .............................................................................................................................. 74 Tabla 4.1. Grado de polimerización (DP) obtenido por RMN de protón, utilizando propargilamina como iniciador. .............................................................................. 80 Tabla 4.2. Estimación del grado de polimerización (DP) de poli-L-lisinas comerciales a partir de los valores de Mw reportados por Sigma-Aldrich. ................................ 80 Tabla 4.3. Peso molecular promedio en peso (Mw) y polidispersidad (Đ) de poli-Llisinas y poli-N-lisinas obtenidas por SEC. ............................................................ 80 Tabla 4.4. Propiedades electrostáticas de las muestras de PLL y PNL... ............. 84 Tabla 4.5. Valores característicos para formación de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 mediante titulaciones de potencial- ........................................... 88 Tabla 4.6. Valores característicos para formación de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 mediante titulaciones conductimétricas: m1, la pendiente característica al exceso de plásmido eGFP-C3 a 0.005 mg/mL; el volumen necesario de policatión, a una concentración de 0.5 mg/mL y pH=7.4 para alcanzar el PI y m2 la pendiente característica al exceso de policatión ............................................... 90 Tabla 4.7. Condiciones experimentales necesarias para la preparación de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 en 1 mL de plásmido peGFP-C3 a 0.034 mg/mL, con soluciones de PLL o PNL, preparadas a 5 mg/mL, a pH=7.4 .. 94 Tabla 4.8. Tiempos característicos obtenidos mediante el ajuste doble y triple exponencial la formación de complejos con PLL20/ peGFP-C3, PNL20/ peGFP-C3, PLLcom860/peGFP-C3 y PLLcom2400/peGFP-C3.. ................................................... 100 Tabla 5.1. Tabla de formulaciones para la preparación de complejos PLL/peGFPC3 y PNL/peGFP-C3 en 0.8 mL de plásmido a 0.034 mg/mL, utilizando soluciones de polipéptidos preparadas a 5 mg/mL y a un pH de 7.4. ................................... 105 Tabla 5.2. Recapitulación de los diámetros hidrodinámicos, índice de polidispersidad (PDI) y potencial- de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFPC3 a diferentes relaciones de carga. ................................................................... 111 Tabla 5.3. Tamaños de partículas determinados mediante DLS y AFM de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 a dilución 1/10. ............................. 114 Tabla 5.4. Pendientes características para los perfiles de intensidad para las mediciones SAXS de complejos con peGFP-C3 y PLL100, PNL100, PLLcom400, PLLcom860, PLLcom1800 y PLLcom2400, preparados a R=10. El Análisis se realizó para las regiones de bajo (1x10-3 a 3x10-3 Å-1), (b) intermedio (3x10-3 a 1x10-2 Å-1) y (c) alto q (1x10-2 a 4x10-2 Å-1). .................................................................................. 117 Tabla 5.5. Parámetros estructurales obtenidos mediante el modelo de frambuesa esférica para el ajuste de los perfiles de dispersión SAXS de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 preparados a R=10. ...................................... 119 Tabla 5.6. Parámetros estructurales obtenidos mediante el modelo núcleo-coraza para el ajuste de los perfiles de dispersión SAXS de los complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 preparados a R=10. ................................................................ 120 Tabla 6.1. Estequiometría de formación de complejos con GAGs, obtenida mediante titulaciones de potencial-z y conductividad, con la adición de PLL100 a C=1 mg/mL y pH=7.4. ............................................................................................................. 131 Tabla 8.1. Cálculo de la concentración necesaria de policatión para definir el PI en 1.1 L de policatión con base en las titulaciones de potencial- y conductividad de soluciones de ADN plasmídico eGFP-C3 (5 mL, C=0.005 mg/mL) con soluciones de policatión (C=0.5 mg/mL, pH=7.4). ...................................................................... 151 Tabla 8.2. Tabla de formulaciones para la determinación de estequiometría mediante electroforesis en gel para complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 ............................................................................................................................ 152 Tabla 8.3. Ejemplo de protocolo para la evaluación de la estabilidad de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 a R=5 en presencia de heparina a 0.1 mg/mL ............................................................................................................................ 154 Tabla 8.4. Cálculos para las soluciones de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 en un Vtotal=3 mL para mediciones de Stopped-flow. ................ 155 Tabla 8.5. Parámetros de mezcla para mediciones de Stopped-flow para un volumen total de tiro de 188 L a una velocidad total de 15 mL/s y un tiempo muerto de 2.4 ms............................................................................................................. 156 Tabla 8.6. Cálculos para la preparación de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFP-C3 en un VpeGFP-C3=800 L a 0.034 mg/mL para diferentes relaciones de carga (1, 5, 10 y 15). ..................................................................................... 157 Tabla 8.7. Cálculos para las diluciones de complejos PLL/peGFP-C3 y PNL/peGFPC3 en un Vtotal=720 L para la transfección en células HEK293. ........................ 158 | |
| dc.format | application/PDF | |
| dc.language.iso | spa | |
| dc.publisher | Biblioteca Digital wdg.biblio | |
| dc.publisher | Universidad de Guadalajara | |
| dc.rights.uri | https://www.riudg.udg.mx/info/politicas.jsp | |
| dc.subject | Moleculas Biologicas | |
| dc.subject | De Complejos Pll/adn Y Pnl/adn Para La Terapia Genica | |
| dc.title | ESTUDIO DE LA FORMACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ESTABILIDAD EN PRESENCIA DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS, DE COMPLEJOS PLL/ADN Y PNL/ADN PARA LA TERAPIA GÉNICA | |
| dc.type | Tesis de Maestría | |
| dc.rights.holder | Universidad de Guadalajara | |
| dc.rights.holder | Bravo Lozano, Lizeth Montserrat | |
| dc.coverage | GUADALAJARA, JALISCO | |
| dc.type.conacyt | masterThesis | |
| dc.degree.name | MAESTRIA EN CIENCIAS EN INGENIERIA QUIMICA | |
| dc.degree.department | CUCEI | |
| dc.degree.grantor | Universidad de Guadalajara | |
| dc.rights.access | openAccess | |
| dc.degree.creator | MAESTRIA EN CIENCIAS EN INGENIERO EN QUIMICA | |
| dc.contributor.director | Figueroa Ochoa, Edgar Benjamin | |
| dc.contributor.codirector | Bravo Anaya, Lourdes Mónica | |
| Aparece en las colecciones: | CUCEI | |
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