Participación del factor de crecimiento endotelial vascular en el daño neuronal inducido en la corteza cerebral motora y el hipocampo por el tratamiento neonatal con glutamato monosódico

Abstract

En el sistema nervioso, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ejerce tanto efectos neuroprotectores como proinflamatorios, según la forma de VEGF (A-E), el tipo de receptor (VEGFR1-3) y las vías de señalización intracelular que estén implicados. El tratamiento neonatal con glutamato monosódico (GMS) sobre-activa los receptores glutamatérgicos y desencadena la muerte neuronal por excitotoxicidad, un proceso común en diferentes padecimientos neurológicos. Además, recientemente se demostró que dicho tratamiento eleva los niveles de expresión de VEGF en el hipocampo, evaluados al día postnatal (DP) 14. Sin embargo, se desconoce cuál es el perfil de expresión de las proteínas VEGF-A, VEGF-B, VEGFR-1 y VEGFR-2 a lo largo del desarrollo postnatal del hipocampo (Hp) y la corteza cerebral motora (CCM); y cómo el tratamiento neonatal con GMS modifica dicho perfil de expresión, así como cuál es su participación en el proceso exicitotóxico generado por el tratamiento. En este trabajo para responder a dichas interrogantes, se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar, distribuidas en los siguientes grupos experimentales: 1) Animales intactos que no recibieron ningún tratamiento (Grupo Intacto); 2) Animales a los que se les administró NaCl equimolar al contenido de Na+ del GMS (1.38 mg/g de peso corporal, s.c.), en los DP1, 3, 5 y 7 (Grupo NaCl); 3) Animales a los que se les administró GMS (4 mg/g de peso corporal, s.c.), en los DP1, 3, 5 y 7 (Grupo GMS); 4) Animales intactos a los que se les administró SU5416 (10 mg/kg de peso corporal, s.c.), inhibidor selectivo del VEGFR-2, en los DP5 y 7 (Grupo SU5416); 5) Animales tratados con GMS (como se describe para el inciso 3) a los que se administró SU5416 (10 mg/kg de peso corporal, s.c.) 30 min antes de la administración de GMS en los DP5 y 7 (Grupo GMS+SU5416). Después de los tratamientos, se realizaron ensayos de “western-blotting” para determinar el nivel de expresión de las proteínas VEGF-A, VEGF-B, VEGFR-1 y VEGFR-2 en muestras de Hp y CCM obtenidas del DP2 al DP60. Además, se determinaron a través de la misma técnica los niveles de expresión de la caspasa-3 constitutiva y fragmentada, así como los de p38/MAPK fosforilada y sin fosforilar. También se determinó la expresión y colocalización de VEGF-A, VEGF-B, VEGFR-1 y VEGFR-2 con NeuN por inmunohistofluorescencia en ambas regiones de interés al DP8. Finalmente, para evaluar el efecto del SU5416 sobre el daño inducido por GMS preparaciones histológicas de las regiones de interés, se analizaron después de la tinción de Hematoxilina y Eosina (H&E), el marcaje con Fluoro-Jade (F-J) y la técnica de TUNEL. Los perfiles de expresión de VEGF-A, VEGF-B, VEGFR-1 y VEGFR-2 fueron específicos para cada proteína en cada región cerebral estudiada. El tratamiento neonatal con NaCl no modificó de forma significativa los perfiles de expresión de las proteínas VEGF-A, VEGF-B y VEGFR-2, por lo que las demás proteínas ya no fueron evaluadas en este grupo. En cambio, el tratamiento neonatal con GMS modificó todos los perfiles de todas las proteínas. En el Hp, aumentó significativamente el nivel de expresión de la proteína VEGF-A en los DP6 y 8, de la proteína VEGF-B en los DP8 y 9 y de la proteína VEGFR-2 del DP21 al DP60; mientras que la expresión de la proteína VEGFR-1 fue disminuida significativamente por el tratamiento en los DP4, 9, 10 y 60. En la CCM, el tratamiento neonatal con GMS aumentó el nivel de expresión de la proteína VEGF-A en los DP8, 9 y 10; de la proteína VEGF-B en los DP2, 6 y 10, disminuyéndolo en los DP8 y 9; de la proteína VEGFR-1 en los DP4, 6, 14 y 21; y de la proteína VEGFR-2 al DP8. Histológicamente, las modificaciones que indujo el tratamiento neonatal con GMS sobre el nivel de expresión de las proteínas VEGF-A, VEGF-B, VEGFR-1 y VEGFR-2 descritas anteriormente para ambas regiones en el DP8, se localizaron a nivel neuronal, aunque no fueron exclusivas de este tipo celular. En relación al perfil de la caspasa-3 nativa, el nivel de expresión de la proteína disminuyó con la edad, mostrando un ligero pico al DP8 en ambas regiones estudiadas y al DP14 en el Hp, este perfil no fue modificado por ninguno de los tratamientos aplicados. De manera similar, aunque en niveles de expresión más bajos, la caspasa-3 fragmentada disminuyó su expresión con la edad y fue significativamentela aumentada por el tratameinto neonatal con GMS en el DP8, sin modificaciones significativas por el tratamiento neonatal con NaCl. Además, el tratamiento neonatal con GMS aumentó la expresión de la proteína p38/MAPK fosforilada en los DP4, 9, 14 y 21 en la CCM; mientras que en el Hp a los DP10, 14 y 21. De acuerdo con lo anterior, histológicamente, se evaluó el efecto del inhibidor de VEGFR-2, el SU5416, sobre el daño inducido por el tratameinto neonatal con GMS del DP6 al DP14. A nivel de la técnica de H&E, se observó que el tratamiento neonatal con GMS genera alteraciones celulares asociadas a procesos degenerativos, que reducen el número de células con morfología “normal” en ambas regiones estudiadas, en tanto que el SU5416 aplicado a animales tratados con GMS, no modificó lo observado en la CCM, pero si disminuyó de forma aún mayor el número de células normales en el Hp, a nivel de CA1 y CA3 en la capa de células piramidales en todas las edades evaluadas. El número de células dañadas, evidenciadas a través del marcaje con F-J, aumentó significativamente después del tratameinto neonatal con GMS del DP6 al DP10 en la capa de células piramidales; y del DP8 al DP10 en la CCM. En ambas regiones, el SU5416 aplicado en los animales tratados con GMS, aumentó el número de células marcadas positivamente con F-J, sin embargo, este efecto fue mucho más pronunciado en el Hp observando aumentos en todas las edades estudiadas, mientras que en la CCM solo se observan al DP8 y 10, pero fueron de mayor magnitud. De igual forma el marcaje para TUNEL evaluado al DP8 y 10, demostró que el tratamiento neonatal con GMS aumenta la apoptosis en ambas regiones, sin embargo, la aplicación de SU5416 a animales tratados con GMS, no modificó lo observado en el Hp, pero sí aumentó aún más el número de células apoptóticas en la CCM. Los resultados muestran que el proceso degenerativo inducido por el tratamiento neonatal con GMS implica la participación de las proteínas VEGF-A, VEGF-B, VEGFR-1 y VEGFR-2 a corto plazo; y que la inhibición de la señalización mediada a través del VEGFR-2 aumenta el daño neuronal inducido por el tratamiento. Lo que sugiere que los aumentos observados en VEGF-A y VEGF-B en respuesta al tratamiento neonatal con GMS, pueden ser parte de los mecanismos compensatorios de neuroprotección que intentan reducir el daño neuronal; e incluso que podrían promover la generación de nuevas neuronas, proceso que quedaría por investigar en trabajos futuros. En este sentido, también quedaría por investigar las implicaciones funcionales que tiene el aumento en la expresión de VEGFR-2 observado del DP21 al DP60 en el Hp.